近红外光谱分析技术在制药领域中的应用
2019-04-18
近红外光谱分析技术在制药领域中的应用
瞿海斌 杨海雷
浙江大学中药科学与工程学系，杭州 310027
近红外光谱区域是人们发现的第一个非可见光谱区域，它是由Hershel在1800年所观察到[1]。但是由于缺乏仪器基础，直到上世纪50年代以前，近红外光谱技术一直没有得到实际应用。上世纪50年代中期以后，随着简易近红外光谱仪的出现及美国农业部的Karl Norris等人所做的工作，使近红外光谱技术在农副产品分析中得到广泛应用[2]。20世纪60年代后，由于中红外光谱技术的快速发展和应用，加之近红外光谱技术自身的灵敏度低、抗干扰性差等缺点，使人们淡漠了该技术在分析测试中的应用。1983年，Wetzel称之为“光谱技术中的沉睡者（Sleeper among spectroscopic techniques）” [1]。
80年代以后，随着计算机技术、化学计量学技术及仪器分析技术的发展和应用，人们重新认识了近红外光谱的价值，并使其发展成为了一门独立的分析技术，1988年成立了国际近红外光谱协会（CNIRS）[3]。由于应用领域的不断扩展，McLure在1994年发表了一篇题为“The giant is running strong”的论文[1]。1998年，Davies撰文讨论了近红外光谱技术的潜在用途和发展趋势，并将其描述为光谱领域中“从沉睡者变为了启明星（from sleeping technique to the morning star of spectroscopy）”的技术[4]。
我国对近红外光谱技术的研究起步较晚，但1995年以来有关这一技术的应用研究逐步增多。目前，已有中国石化研究总院和北京第二光学仪器厂开发出商用近红外光谱仪[5]。
1. 近红外光谱分析技术简介
1.1 近红外光谱特征和应用特点
近红外光指可见光谱区到中红外光谱区之间的电磁波，美国材料实验协会（American Society for Testing and Materials，ASTM）将近红外谱区的范围定义为780 ~ 2526 nm（12820 ~ 3959 cm-1），其光谱信息来源于分子内部振动的倍频吸收与合频吸收。通常把近红外光谱分为两段，即短近红外波段（SW-NIR，700 ~ 1100 nm）和长近红外波段（LW-NIR，1100 ~ 2500 nm）[6]。图1-1为近红外波长范围示意图。
图1-1 近红外光谱波长范围及其特点
近红外光是一种电磁波，具有光的属性，即同时具有“波”及“粒”的二重性，我们对光的能量可以用光子表示为：
其中，
为普兰克常数，
为光的频率。
近红外的光子能量也可以用上述公式定量描述。从光源发出的红外光照射到由一种或多种分子组成的物质上，如果分子振动或转动状态变化或者分子振动或转动状态在不同能级间的跃迁，等于近红外光谱区域某波长处光子的能量，则产生近红外光谱吸收。分子的能量跃迁包括基频跃迁（对应于分子振动状态在相邻振动能级之间的跃迁）、倍频跃迁（对应于分子振动状态在相隔一个或几个振动能级之间的跃迁）和合频跃迁（对应于分子两种振动状态的能级同时发生跃迁）。
近红外光谱信息主要反映的是有机物分子中C-H、N-H、O-H等含氢基团的在中红外吸收基频(4000－1600cm-1)的倍频和合频吸收，这些含氢基团吸收频率特征性强，受分子内外环境的影响小，而且在近红外谱区比中红外谱区的样品光谱特性更稳定。近红外与其它电磁波谱所包含信息的比较见表1。
表1. 不同电磁波谱区域的光谱特征
| 光谱范围 | 波长 (nm) | 光谱特征 |
| 紫外 | 190-360 | 离域π电子跃迁，如芳环特征等 |
| 可见光 | 360-780 | 电子跃迁：如颜色的测量 |
| 近红外 | 780-2500 | 分子振动基频的倍频和合频的谱带 |
| 中红外 | 2500-25000 | 基频分子振动：伸缩，弯曲，摇摆和剪切 |
近红外波段的光谱特征决定了近红外光谱分析技术与常规分析技术相比，具有显著的优越性[1]：
①分析对象广泛：近红外光谱几乎可用于所有与含氢基团有关的样品物化性质分析，不仅能反映绝大多数有机化合物的组成和结构信息，对某些无近红外光谱吸收的物质（如某些无机离子化合物），也可通过它对共存的本体物质影响引起的光谱变化，间接地反映它存在的信息。适合近红外光谱测量的物质种类范围和场合非常广泛。
②物质在近红外区域的吸收系数小，分析过程简单：作为分子振动能级跃迁产生的吸收光谱，近红外区域的倍频或合频吸收系数很小，一般较红外吸收低1~3个数量级，故样品无需用溶剂稀释即可直接测定，便于生产过程的实时测定。所用样品池的光程不像中红外区常在1 mm以下，近红外区域根据所使用的谱带和测试物含量的高低，光程可以是1 ~ 100mm，长样品池使清洗过程变得非常方便。虽然吸收系数小会妨碍样品中微量杂质的测定，但也保证了微量杂质或在近红外吸收弱的组分不至于干扰测定。
③适用于漫反射技术：近红外区内光散射效应大，且穿透深度大，使得近红外光谱技术可以用漫反射技术对样品直接测定。漫反射光进入样品内部，经过多次反射、折射、衍射及吸收后返回样品表面，负载了样品内部的结构和组成信息。固体样品可以是任何形状，如水果、谷物或固体药丸都可以直接测定，便于检测各部位或每一颗粒的质量。
④近红外光可以在玻璃或石英介质中穿透，可使用光纤传输：近红外区的波长短，因而不被玻璃或石英介质所吸收。所用的样品池容器可以用常用的玻璃或石英制成，价格低廉，使用方便。有时可以直接在玻璃容器中进行测定，而无需打开密封的容器，避免样品的转移手续及不必要的污染。近红外光的这一特性，更重要的是一般玻璃或石英光纤可以用于近红外光谱技术，使传统的近红外光谱技术扩展到了过程分析及有毒材料或恶劣环境中样品的远程分析，同时也使光谱仪的设计得以更多用，且小型化。
⑤分析快速简便：在大多数情况下，从分析一个样品到获得结果不到一分钟，成本较低。同时仪器的高度自动化降低了对操作者的技能要求。
⑥不破坏样品，不用溶剂，无环境污染：近红外光谱分析中只需取得样品的光谱信号，有时甚至可直接在原容器中进行测定，不使用其它溶剂，样品测定后一般可送回生产地或容器，测试过程中不产生污染。
⑦分析结果准确可靠：由于无需样品预处理步骤，减少了人为因素带来的实验误差，近红外光谱分析结果的准确性与其它分析技术相比更为可靠。
⑧可用于测定样品的非化学性质：近红外光谱不仅可以反映样品的化学组成和结构信息，还可以反应样品的物理性质。基于各种物理参数对近红外光谱的影响，它还可以用于测定固体样品的紧密度、颗粒尺寸，液体样品的密度和稠状样品的粘度等性质。
和任何一种其它分析技术一样，近红外光谱分析技术也有其自身的局限性[1]：
①近红外光谱分析专一性差，必须使用化学计量学技术来提取相关信息，才能实现对待测样品的分析。②建模时需要大量样品，按分析指标的不同，要求建模样品的性质涵盖的范围足够宽，且尽可能分布均匀。③不适合于痕量分析及分散性样品的分析。近红外光谱分析难以进行痕量分析。且因建立准确的校正模型需花费大量人力物力财力，此方法对于常规质量控制经济快速，但不适用于偶尔的分析或分散性样品。
1.2 近红外光谱分析操作流程
近红外技术是依据某一化学成分对近红外区光谱的吸收特性而进行的定量测定，所以应用近红外光谱进行检测的技术关键就是在两者之间建立一种定量的函数关系，依靠这种关系，就能从未知样品的光谱中求出样品的成分和含量。为此，近红外光谱分析基本流程包括：
①收集具有代表性的样品（其组成及其变化范围接近于待测样品），然后采集样品的光谱。值得注意的是，校正集样品的组成非常重要，必须结合实际情况，校正集样品的化学和物理性质范围必须涵盖待测样品的所有可能范围，并要求分布尽可能均匀，避免共线性现象。一般而言，对于一个单组分系统，校正集至少由20个样品组成。
②利用标准的方法（参考方法）对样品性质进行测定。参考方法测定结果的准确性直接影响校正模型的可靠性。
③光谱信号经过预处理后，通过数学方法将这些光谱数据和检测的数据进行关联，建立定性或定量校正模型。一般采用内部交叉验证和外部验证选择建模方法和优化模型参数。对应的模型性能评价指标有复相关系数（R2）、内部交叉验证均方差（RMSECV）、预测均方差（RMSEP）及相对偏差（RSECV、RSEP）来考察所建立的模型的性能和预测效果。计算公式如下：
式中：
是标准方法测得的值，
是近红外预测值，
是平均值，
是校正集样品数，m为预测集样品数。④未知样品分析。扫描待测样品的近红外光谱，输入到所建立的校正模型，即可计算出其性质。
近红外光谱分析的流程如图1-2。
图1-2 近红外光谱分析流程图
在上述几个步骤中，校正集样品的收集和标准方法测定的工作直接关系到校正模型的准确性和推广性。校正模型的建立是近红外分析技术的核心。一般商用近红外仪器均带有常用的定性和定量分析软件，可用于校正模型的建立。
2. 近红外技术在制药领域中的应用
药品生产过程的质量控制要求，为了确保最终产品的质量稳定均一，需要对从原料接收到产品出库的整个物料流通过程进行全程监测。近红外光谱分析技术的特点决定了其在这一领域可以发挥重要作用。图2-1显示了近红外光谱技术在制药过程中可应用的环节。
图2-1 近红外光谱分析技术在制药过程中的应用
2.1原料质量控制
药品生产中的原料主要有原料药品、天然产物和医药辅料等。近红外光谱在原料药品和天然产物鉴别、辅料识别、活性组分含量测定等方面均得到了广泛应用。
1．原料药的判别分析
早在1988年，Rostaing等[7]就应用傅立叶变换红外光谱和近红外漫反射光谱对制药原料进行了快速鉴别。1995年，Van等[8]首先建立了各种原料的标准指纹近红外谱库，对来源不同、在化学或物理性状方面只具有微小差异的原料，实现了正确判别。Smola等[9]也报道了近红外在原料药判别分析上的应用。Ulmschneider等[10]采用近红外直接识别了装在密闭玻璃瓶里的9种活性药物中间体，并发展了一个用于判别分析的可转移的基础光谱库。Blanco等[11]提出了建立用于药物原料识别近红外光谱库的步骤和策略，使用相关系数作判别准则，库中化合物的数目可根据需要进行扩容。对于用近红外谱图库还难以细分的相似物，他们提出建立层叠子库的设想，即采用马氏距离或者残余方差方法作进一步的识别，实验证明其分类和判别效果良好。
2．天然产物及中药材的定性鉴别
天然药物如中药材的鉴别一直是生药学的一项主要研究工作。由于地理位置、气候条件、生长环境等因素差异，不同产地的同一类药材在活性成分的含量和种类上往往相差较大。另外，在药材市场上还有大量假冒伪劣药品存在。中药材在长期的发展过程中，已形成一套较完整的生药鉴定方法，但这些方法多是建立在专家的主观经验或者复杂繁琐的传统化学分析方法上。
近红外光谱在复杂天然产物的定性分析中得到了许多成功的应用。这些应用包括同属药材鉴别[12]、产地鉴别[13]、药材部位鉴别[14]、真伪鉴别[15]。
3．辅料识别
Dreassi等[16]用线性判别方法，识别了在基本物理参数如密度和结晶度等方面具有差异的不同药用辅料。Candolfi等[17]用近红外光谱和SIMCA方法识别了10种药物辅料（无水磷酸氢二钙、无水乳糖、乳糖、硬脂酸镁、淀粉、硫酸月桂酸钠、聚乙烯吡咯烷酮与微晶纤维素等）。Kreft等[18]识别5种不同的聚乙烯吡咯烷酮PVP（K-25、30、90F、12PF、17PF等）。Ulmschneider等[19]提出了用于识别固体药剂辅料的传递聚类方法。Krämer等[20]采用近红外光谱法对微晶纤维素、粉末纤维素以及甲基、乙基、羟乙基、羟丙基、甲基羟乙基、甲基羟丙基等结构极为相似的纤维素等8种辅料成功地进行了分类。
2.2 药物生产过程监测
近红外光谱分析技术在制药过程主要环节如化学反应过程监测、制剂过程等均有应用研究。具体来说，近红外光谱在线检测药品生产过程涉及到了混合[21]、造粒过程干燥[22]、包衣[23]、消毒[24]、反应过程监测[25]、发酵过程检测[26]等各方面。刘全等[27]将此技术应用于中药的渗漉提取过程分析中，杨南林等[28]则对中药大孔吸附树脂纯化过程进行了近红外在线检测的研究，均取得了很好的结果。图2-2显示了生产过程中进行监测的一些应用。
图2-2 近红外光谱分析技术在药品生产过程中的应用
2.3 成品药分析
1. 活性组分含量测定
近年来，近红外光谱分析技术在药物活性组分的定量分析方面得到了广泛应用。这些应用包括天然产物[29~33]和化学药物[34,35]两方面，已对三七中的有效成分及总皂苷[29,30]、冬虫夏草中的甘露醇[31]，氨基酸[32]以及黄连中的生物碱[33]进行了含量测定，透射[29,30,34]和漫反射[31~33,35]技术均有应用。
2. 固体制剂物化参数的表征
固体制剂（如片剂、胶囊、颗粒及粉末等）是一类重要的药品制剂，大部分的口服药都是固体剂。固体制剂的物理性质如颗粒大小、湿度及结晶度对药物的稳定性、溶解性及生物利用度等都有很大的影响。
近红外光谱不仅可以反映样品的化学组成和结构信息，还可以反应样品的物理性质。由于近红外光在固体中的穿透程度相对较深以及适宜采用漫反射技术的特点，使它成功地用于固体制剂的各种物理化学性质如湿度[36]、颗粒大小分布[37]、结晶度[38]及硬度[39]的定量表征。
3. 真假药品判别
Dempster等[40]用漫反射近红外识别了临床使用中具有多种效价的同一药品以及过期药品等。Sergio等[41]运用近红外反射和透射光谱对12种片剂，以及胶囊剂、涂剂和液体制剂进行了真假识别。
总之，近红外光谱分析技术在制药领域中的应用已经得到了广泛研究，并已在许多领域得到了成功应用，如原料，成品的生产现场或实验室的定性鉴别和定量分析；药品质量辅助指标如药品的溶出度等的分析；原料药工艺过程中反应程度及反应终点判断；制剂过程中的参数检测；真伪药品的鉴别；包装材料的分析等。但是，由于近红外光谱技术是一门结合分析化学和化学计量学的分析技术，是一种二级分析方法，其定量定性分析均依赖一套标准样品和标准分析方法，并且需要复杂的化学统计学的数学处理，才能保证在实际应用中获得满意的分析结果。随着标准数据库的建立和完善，数学软件的开发，相应辅助测试设备的设计，近红外光谱技术在医药领域展现了广泛的应用前景。
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